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                    李曼大會淺析

                    更新日期:2019年11月28日 大字 小字
                    sis Enhancer 溶液至樣品中,65 ℃孵育10 min。

                    3.劇烈渦旋震蕩10min。

                    (此步驟可選用研磨儀,頻率:6.5 m/sec ,處理時間:30S,10個循環)



                    4.14000 rpm離心5 min,轉移上清400 μl到新的1.5 ml的離心管中。

                    (注意:離心后上清表面可能出現一層雜質,避免吸取這些雜質,因為這些雜質會影響下游的擴增

                    5.加入250 μl S3-Cleanup Buffer,立即徹底混勻。

                    6.14000 rpm離心2 min,轉移全部上清液(約500 μl)到 預分裝板的孔1、7中。

                    打開核酸自動提取儀,選擇編輯程序并命名“environmental samples”,按照下表進行編輯。

                    7. 插入磁棒套,運行編輯好的程序,25min左右程序結束,轉移洗脫孔6、12中的DNA至新的離心管-20℃保存或直接進入q-PCR 檢測。


                    q-PCR檢測 


                    1、非洲豬瘟擴增反應液的配制

                    取出PCR反應液,室溫融化后,取相應份數(反應液20μl/T、Taq 酶0.2μl/T)混勻,然后向各PCR反應管按20μl分裝;再分別加入 5μl抽提好的DNA模板或陰/陽性對照,蓋好管蓋;將反應管置于 全自動熒光PCR檢測儀中,參照儀器操作說明設定陰/陽性對照、 待檢樣本參數進行PCR反應,記錄好樣本擺放順序。反應體系如下表:


                    2、 Q-PCR儀的設置反應程序設定

                    第一步: 94 °C15分鐘;第二步:95 °C10 秒,55 °C 35 秒,45 個循環; 熒光素設定為FAM在反應程序的第二步55°C末讀取熒光值。


                     陰陽性判斷:


                    超寬線性范圍,擴增檢測單拷貝,超高靈敏度


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